ЦМД


Перейти до змісту

Світлова мікроскопія

Методики

Гістологічне дослідження (приготування гістологічних мікропрепаратів)


Для отримання якісних гістологічних препаратів важливою умовою є якнайшвидше отримання матеріалу, мінімальна травматизація тканини і адекватна фіксація. Оптимальна площа шматочків тканини 2-3 см, товщина 5-7 мм. Фіксація забезпечує стабілізацію тканинних структур і їх ущільнення – механізм дії фіксаторів ґрунтується на коагуляції білків і стабілізації ліпідів. Для кожного конкретного виду досліджень підбирається найбільш прийнятний фіксатор.
Загальні принципи фіксації:
•після вирізки шматочка тканини його негайно занурюють у фіксатор;
•об'єм фіксатора повинен перевищувати об'єм матеріалу в 10-20 раз (тканинна рідина може суттєво змінити концентрацію фіксатора);
•після зміни кольору фіксатора після занурення в нього шматочків тканини, фіксатор необхідно замінити;
•не допускається повторного використання фіксаторів;
•для кожного фіксатора необхідно дотримуватися встановленого часу фіксації.
Основним фіксатором в гістологічній практиці є формалін, який представляє собою 40% розчин формальдегіду. З нього виготовляють нейтральний (забуферений до рН 7,0) 10-12% формалін. Для цього до 40% розчину формаліну додають карбонат кальцію із розрахунку 100 г на 1 л формаліну. Для отримання 10% нейтрального формаліну через 24 години до 1 частини 40% нейтрального формаліну додають 9 частин водопровідної води. Тривалість фіксації 24-48 год при 20 С. Після фіксації, для якої застосовувався формалін, шматочки промивають на протязі 6, 12 або 24 год у проточній воді.
Перед заливкою матеріалу у парафін, його необхідно зневоднити. Найбільш поширеним є зневоднення у спиртах зростаючої концентрації, починаючи з 70%. Звичайно використовують послідовність, яка складається з двох порцій 96% і двох – 100% етилового спирту. Тривалість процесу зневоднення у спиртах у середньому 48 годин у залежності від якості матеріалу (вміст жиру у тканині) і розміру шматочків.
Для отримання тонких (5-7 мкм) гістологічних зрізів необхідно фіксований і промитий матеріал заливають у щільне середовище – найчастіше парафін. Найбільш поширена схема Меркулова.
Фіксація:
Формалін 10% 24 год
Зневоднення:
Спирт 96% І 24 год
Спирт 96% ІІ 2 год
Спирт 100% І 24 год
Спирт 100% ІІ 2 год
Заливка у парафін:
Спирт+ксилол (1:1) 1-3 год
Ксилол+парафін (1:1 – «каша») 37 С 1-2 год
Парафін І 56 С 2 год
Парафін ІІ 56 С 1 год
Приготування парафінових блоків. Просочені парафіном шматочки тканини викладують у спеціальні формочки і заливають розплавленим у термостаті або на водяній бані при 60 С парафіном, у який додано 1-3% воску. Викладення шматочків у формочки і їх орієнтування швидко виконують теплим пінцетом. Парафін повинен на 3-4 мм виступати над поверхнею блока, якщо його монтують на дерев'яний брусок. Надлишковий парафін та монтаж блока на дерев'яні бруски здійснюють підігрітого на спиртівці металевого шпателя або скальпеля.
Приготування парафінових зрізів за допомогою санного мікротома.
Парафіновий блок затискають у об'єктотримачі мікротома і встановлюють необхідний кут нахилу ножа (оптимальний 13-15 C) у залежності від щільності матеріалу. Спочатку вирівнюються поверхню блока, встановивши мікрометрична шкалу на отримання товстих (20-25 мкм) зрізів, потім шкалу переводять на 6-8 мкм і приступають до різання матеріалу. Зрізи з блоку обережно знімають за допомогою сухої або змоченого у спирті пензлика, також використовують препарувальну голку, зубний зонд, скальпель, тощо. Часто зрізи наклеюють на предметне скло безпосередньо з ножа. Для цього їх переносятьу склянку (або чашку Петрі) з теплою водою (35-40 С), а потім виловлюють на предметне скло, які попередньо знежирюють і натирають білком з гліцерином. Зрізи приклеюють на предметне скло блискучою, зверненою до ножа стороною. Потім зрізи просушують у термостаті при температурі 37 С впродовж 6-12 год.
Депарафінування зрізів. Парафінові зрізі перед забарвленням вивільняють від парафіну за допомогою розчинника (частіше використовується ксилол) по схемі:
Ксилол І 10-15 хв
Ксилол ІІ 3-5 хв
Спирт 100% І 1-2 хв
Спирт 100% ІІ ополоснути
Спирт 96% І «
Спирт 96% ІІ «
Дистильована вода 2 зміни
Депарафіновані зрізи готові до забарвлення, після короткочасного просушування на повітрі.
Забарвлення. Препарати можна занурювати у фарбуючий розчин у спеціальних контейнерах, якщо препаратів небагато, то раціональніше барвник наносити по краплях за допомогою піпетки. Після того як препарат набуває інтенсивного забарвлення, його промивають у воді або спирті для видалення залишків барвника (диференціювання), контролюючи цей процес під мікроскопом.
Заключення зрізів. Добре зневоднені у спиртах і просвітлені у карболксилолі, а потім і у чистому ксилолі препарати готові до заключення у спеціальні смоли. Для цього використовують смоли природного походження – бальзами (канадський, пихтів або кедровий). У практичній морфології використовують синтетичну пластмасу - полістирол. Полістирол добре розчиняється у ксилолі і толуолі, прозорий і швидко загусає. Існує кілька варіантів виготовлення полістиролу для заключення препаратів:
мл 30% розчину полістиролу у ксилолі змішують з 6 мл дибутилфталату;
суміш, яка складається з 100 г полістиролу, 100 мл ксилола і 12 мл дибутилфталату розчиняють при 22 С або у термостаті при 37 С, періодично помішуючи.


Повернутися до змісту | Повернутися до головного меню